阿片类药物是现在临床普遍使用的强效镇痛药物。但镇痛的同时还会引起大脑中强烈的兴奋作用，停药会引起难以忍受的戒断症状，从而导致成瘾。
2023年1月19日，西安交通大学国家生物证据清静基地与厦门大学医学院、西安精神卫生中心等单位相助在Cell杂志揭晓文章展现了阿片类药物驱动懦弱样调理性 T 细胞的外周扩张，这些细胞穿过血脑屏障，并通过 IFN-γ 介导突触不稳固和随后的戒断症状。阿片类药物成瘾尚无有用治疗要领，这一研究提出了通过远端免疫治疗靶向对抗中枢神经系统功效障碍的可能，有望通过免疫干预治疗阿片成瘾。
摘要
免疫系统失调是阿片类药物成瘾的一个主要特征。研究职员形貌了阿片类药物使用障碍患者和康健比照者的外周免疫细胞的情形。阿片类药物相关血液中的免疫细胞泛起异常漫衍，其特征是懦弱样调理性 T 细胞显著扩张，与戒断评分呈正相关。
阿片类药物治疗的小鼠也体现出 Treg 衍生的滋扰素-γ (IFN-γ) 表达增强。IFN-γ 信号重塑了伏隔核 (NAc) 神经元的突触形态，调理随后的戒断症状。研究证实阿片类药物通过下调星形胶质细胞衍生的脂肪酸团结卵白 7 (Fabp7) 来增添神经元衍生的 C-C 基序趋化因子配体 2 (Ccl2) 的表达并破损血脑屏障的完整性，这两者触发了外周 T细胞浸润至 NAc。
这一研究批注，阿片类药物会驱动懦弱样调理性T细胞的扩张，并有利于外周调理性T细胞穿过血脑屏障，从而导致IFN-γ介导的突触不稳固和随后的戒断症状。
研究配景
阿片类药物具有强效镇痛作用，可是由于其强烈的兴奋作用，这类药物也是最容易上瘾的。NAc是调理夸奖和厌恶历程的要害脑区。吗啡诱导的NAc区域形态重塑与行为敏化、依赖和戒断有关。别的，吗啡可增进炎症因子的渗透，加重神经免疫反应。然而外周免疫细胞及其渗透的细胞因子是否与中枢神经系统（CNS）相互作用以调理突触结构或成瘾行为仍然是未知的。
调理性T细胞（Tregs）是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，在免疫抑制中具有要害作用，其标记物为转录因子Foxp3，该功效性细胞群缺失后引起致命的自身免疫性疾病。懦弱样Tregs保存Foxp3表达但失去抑制功效。缺氧导致HIF1α表达升高，进而引起懦弱样Tregs爆发IFN-γ。
本研究报道了阿片类药物使用障碍患者中懦弱样Tregs群的扩大，其特征是渗透 IFN-γ 以及一连表达 HIF1α。施用阿片类药物后，在小鼠的血液和 NAc 中也发明了类似的亚群。别的，懦弱样Tregs爆发的IFN-γ会导致突触功效障碍和随后的戒断症状。研究职员进一步确定了懦弱样Tregs穿过血脑屏障的机制。
研究要领
这一研究项目招募了阿片类药物使用障碍患者21例（其中男18例，女3例），平均年岁40.7±9.0岁；康健比照组20例（男17例，女3例），平均年岁(35.8±3.6)岁。对人的外周血单核细胞 (PBMCs)样本举行质谱流式细胞剖析；提取PBMCs的总RNA举行基因表达剖析。
动物实验选用6-8周龄雄性小鼠，每隔3天给小鼠腹腔注射200 mg/剂量的抗鼠IFN-γ以在体内阻断IFN-γ。天天给比照组小鼠腹腔注射两次盐水；一连7天给实验组小鼠注射吗啡（从 10 至 50 mg/kg 递增；或 5 至 10 mg/kg递增一连28天），在吗啡注射后30分钟测定小鼠动脉血氧饱和度，最后一次注射后48小时网络组织样本。监测并纪录吗啡戒断48小时后的小鼠躯体症状。每组随机取三只小鼠，获取NAc组织，举行一系列免疫实验。提取NAc组织的总RNA举行TCR免疫组库测序剖析。测定小鼠血脑屏障渗透性，并对小鼠脑组织结构形态举行显微成像剖析。
研究效果
1. 阿片类药物引起外周懦弱样Tregs增添
对阿片类药物使用障碍患者外周血的剖析批注，差别免疫细胞亚群中的多种抑制标记物和激活标记物均有所增强（图 1F）。转录因子Foxp3在种种细胞亚群中普遍共表达，在阿片类药物相关血液中显著增添（图 1G）。Foxp3High细胞共表达CCR7、CD45RA和CD163等（图1H、1I）。在阿片类药物使用障碍患者的PBMCs中，一系列细胞因子基因和指示细胞激活的基因表达增添(图1J)。流式细胞术剖析显示血液中的Tregs及其爆发的IFN-γ水平升高（图1K），而在其他细胞亚群中没有视察到显着的IFN-γ水平转变。阿片类药物相关血液中的IFN-γ+细胞高表达HIF1α和IFNG（图1L和1M），说明血液中懦弱样Treg亚群增多。
研究发明 Foxp3 和 CD163 之间泛起显著的正相关性。Foxp3表达与戒断评分呈正相关性（图 1N和1O）。别的，Tregs 衍生的 IFNG 相对表达水平与戒断评分呈正相关（图 1P），批注懦弱样Tregs可能加入阿片类药物引起的戒断症状。
图1阿片类药物使用障碍患者外周免疫情形的判断
2. 吗啡导致NAc区域脆性样Tregs浸润和突触可塑性
研究职员在吗啡治疗小鼠的NAc组织中检测到大宗Foxp3+细胞，并且增多的IFN-γ+细胞显示出CD4+Foxp3+ Tregs的特征（图 2D）。为了研究浸润T细胞是否源自外周血或NAc 中常驻T细胞的增殖，通过IR-seq检测TCR β链克隆型。吗啡治疗后检测到V、VJ、VDJ 和CDR3 aa克隆型增多（图2J-2K）。吗啡处置惩罚后，NAc中CDR3 aa 克隆型的多样性显著升高（图2L、2M）。
这些数据批注阿片类药物会诱导外周T细胞浸润。吗啡处置惩罚组的NAc神经元粗刺和细刺的比例划分镌汰和增添（图2N-2P），这批注吗啡袒露后中型棘突神经元（MSN）的未成熟/不稳固突触结构增添。然而，在吗啡处置惩罚的小鼠中，差池称突触的数目和这些突触活跃区的长度划分增添和镌汰（图2Q 和 2R），这批注兴奋性突触功效削弱。这些形态学转变效果批注吗啡处置惩罚会导致NAc中的突触削弱。
图2 阿片类药物治疗导致NAc中懦弱样Treg浸润和突触可塑性
3. 消除IFN-γ可避免NAc突触削弱
为了确定IFN-γ是否影响NAc中的突触可塑性，在吗啡治疗前给小鼠施用IFN-γ（抗 IFN-γ）。阻断IFN-γ并不可阻止Tregs浸润，但会降低NAc中的IFN-γ水平。同时，神经元粗刺的比例增添，细刺的比例镌汰（图3D、3E）。别的，这些突触运动区的长度增添，批注突触功效增强（图3F）。形态学效果批注潜在的突触弱化效应被阻止了。与吗啡处置惩罚的小鼠一样，IfngcKO小鼠也显示Tregs浸润到NAc中（图3G）。然而，吗啡治疗后，NAc 中Tregs爆发的IFN-γ量显著镌汰（图3H、3I）。
图3 消除IFN-γ可避免NAc诱导的突触削弱
4. NAc神经元IFN-γ信号调理突触可塑性
为了评估IFN-γ在神经元信号传导中的作用，研究职员使用hsyn驱动的tet-on系统降低了NAc中IFN-γ受体 R1 (Ifngr1) 的表达水平。Ifngr1 shRNA有用降低了Ifngr1表达，但不降低IFN-γ水平（图4D）。免疫荧光染色显示，吗啡治疗后，NAc中Stat1（IFN-γ 信号通路中的响应基因）的表达增添。当Ifngr1下调时，增强型Stat1被tet-on系统抑制（图4E）。Wnt家族和Bst2是IFN-γ信号传导的靶标，在突触形成和损伤中施展要害作用。
研究职员进一步检测了NAc中Wnt10b和Bst2的表达。阻断IFN-γ信号传导抑制了吗啡诱导的 Wnt10b 表达（图 4F），而 Bst2 表达则无显着转变。当Ifngr1被敲低后，吗啡诱导的突触削弱不再爆发（图 4G-4K）。阻断IFN-γ信号传导后，戒断症状也获得了改善（图4L）。这些数据批注，吗啡激活IFN-γ信号，诱导 NAc 的高度突触可塑性。
图4 NAc神经元IFN-γ信号调理突触可塑性
5. 阿片类药物增进Ccl2介导的Treg召募
与比照组相比，吗啡处置惩罚后NAc中的Ccl2表达增添，而血液中的Ccl2没有显著差别，批注Ccl2的增添源于NAc（图5A）。免疫荧光剖析批注，增多的Ccl2来自神经元而非星形胶质细胞（图5B）。虽然敲除Treg中的Ccr2并不会改变神经元中Ccl2的表达（图5C），但吗啡处置惩罚的Ccr2cKO小鼠显示出较少的Treg浸润、较低的IFN-γ爆发和Stat1表达（图5D-5F）。别的，吗啡诱导的突触削弱（图5G-5I）和戒断症状（图5J）在 Ccr2cKO小鼠中也获得了预防。Stat1 信号传导可以驱动神经元 Ccl2 表达。可是Ifngr1的下调不会改变吗啡诱导的Ccl2和Foxp3染色，批注吗啡增进神经元的Ccl2表达和Treg召募并不依赖于Stat1信号传导，而是神经元通过μ-阿片类受体爆发Ccl2。
图5 Foxp3+特异性敲除 Ccr2可改善 NAc 中吗啡诱导的效果
6. 阿片类药物通过降低Fabp7破损血脑屏障增进Tregs浸润
Fabp7的表达和IFN-γ的水平之间保存显着相关性。在吗啡处置惩罚的小鼠中，总Fabp7（图 6D）和星形胶质细胞衍生的Fabp7（图6E）均显著镌汰。研究职员使用伊文思蓝（EB）验证血脑屏障的渗透性，发明吗啡处置惩罚的NAc中EB外渗增添（图6F和6G）。IfngcKO小鼠还体现出吗啡诱导的Fabp7 mRNA和卵白质镌汰（图6H和6I），说明Fabp7的镌汰是吗啡引起而不是通过IFN-γ引起的；指碏abp7的表达会显著降低NAc中IFN-γ的水平，但Fabp7过表达不影响血液中IFN-γ的量。研究职员发明这可以避免吗啡诱导的血脑屏障破损（图7D、7E）和Treg浸润（图7F）。免疫荧光染色证实恢复星形胶质细胞中Fabp7的表达不会镌汰MSN爆发的Ccl2（图 7G），批注Ccl2升高是吗啡造成，与Treg浸润无关。血脑屏障完整性的恢复确实镌汰了吗啡介导的Stat1表达，导致IFN-γ信号传导镌汰（图7H）。与比照组相比，吗啡处置惩罚的小鼠中Fabp7的上调可以拯救突触削弱并改善吗啡用药后的戒断症状。
图6 吗啡引发Fabp7镌汰和血脑屏障高通透性
图7 Fabp7关于阿片类药物相关的血脑屏障通透性至关主要
研究结论
这项研究展现了阿片类药物使用障碍患者的外周免疫情形。研究批注阿片类药物引起的缺氧引发的外周血泉源的懦弱样Tregs会爆发IFN-γ并渗透到NAc中，重塑突触可塑性，从而调理戒断症状。阿片类药物刺激不但会增添MSN衍生的Ccl2，还会抑制星形胶质细胞衍生的 Fabp7，增进懦弱样Tregs进入中枢神经系统。这项研究剖析了懦弱样Tregs跨血脑屏障运输的机制，深入相识了IFN-γ信号通路在调理 MSN 结构和功效中的作用。这种“血脑屏障通透性/懦弱样Tregs 浸润/IFN-γ信号传导/戒断症状”轴可能为阿片类药物依赖患者开发有用的免疫治疗战略提供依据。
西安交通大学法医学院朱永生、严鹏为本文章的配合第一作者。该事情受到国家自然科学基金、陕西省自然科学基金、福建省自然科学基金以及厦门大学校长基金等资助和支持。
参考文献：
Zhu et al., Opioid-induced fragile-like regulatory T cells contribute to withdrawal, Cell (2023)