在细胞生物学中，基因过表达和敲除/敲降手艺通常成对用于研究选定的基因。在肠道微生物群研究中，细菌植入和悉生动物模子常用于研究感兴趣的细菌。然而还没有敲除/敲低细菌的标准计划可用于肠道微生物群研究。
近期，欧博官网生物首创人朱峰教授与多位科研职员相助在Cell子刊《Cell Reports Methods》上揭晓论文。该研究立异性地提出了噬菌体定向敲除肠道细菌动物模子（Targeted-Bacterium-Depleted mouse model, TBD），充分验证了TBD模子可以靶向敲除目的肠道微生物群，接受噬菌体处置惩罚的动物体现出除目的细菌敲除外险些完整的肠道细菌谱。这一发明为研究肠-脑轴动物模子的建设提供了一个全新的要领，并有望成为研究肠道微生物群相关疾病的有力工具。
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Cell Reports Methods简介
Cell Reports Methods是Cell Press在2021年推出的一本开放获取多学科期刊，是CNS子刊中除Nature Methods外唯一的要领学专刊，更着重于可重复的稳健要领。关注的领域包括测序和成像手艺、基因组编辑、单分子要领、盘算要领、生物手艺和合成生物学等方面的立异要领。
摘要
肠道微生物组对人类康健至关主要。小鼠微生物群模子，包括悉生小鼠，是剖析肠道细菌功效的最有用工具。这篇文章提出了一种靶向细菌敲除（TBD）模子，使用裂解噬菌体选择性地敲除康健或其他模子小鼠的肠道细菌。这些噬菌体处置惩罚的动物除了敲除的细菌，应该具有险些完整的肠道细菌谱。为了证实这一看法，研究者接纳大肠杆菌特异性噬菌体T7来抑制康健小鼠中的大肠杆菌。实验效果批注，敲除大肠杆菌的小鼠体现出勇敢的行为，这与大肠杆菌的保存而非肠道细菌之间的平衡有关。因此，研究者证实TBD模子是一种可用于剖析近乎完整肠道微生物群情形中特定细菌物种功效的有力工具。
研究配景
肠道是人体中最大的微生物群库，保存着一系列细菌、真核生物和病毒。肠道细菌的多样性和相互作用极大地影响宿主的新陈代谢，与人类康健的诸多方面息息相关。例如，肠道微生物群可以调控宿主免疫反应，微生物群组成的改变能够影响一系列疾病的爆发生长。别的，药物作用通；岫猿Φ牢⑸锶罕⒂跋。药物-细菌相互作用对用于治疗精神破碎症等精神疾病的疗法爆发了深远影响。
微生物群-肠-脑轴（MGB）是微生物群-宿主相互作用的典典范子。MGB从肠-脑轴（GBA）扩展而来，GBA形貌了大脑和肠道神经系统之间的双向通讯，MGA则形貌了肠道微生物群与中枢神经系统之间的关系。例如，肠道微生物可以爆发神经活性分子，通过迷走神经在肠道神经系统和大脑之间转达信号。在胁迫条件下，微生物群的组成也可以通过肠上皮细胞，经由下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴通过举行调理。某些肠道细菌的品貌与心理康健状态相关，称为心理生物组（psychobiome）。例如，肠道中的前庭链球菌（Streptococcus vestibularis）可以诱导精神破碎症样行为，抑郁症患者的粪球菌属（Coprococcus）和小杆菌属（Dialister）水平通常降低。
大肠杆菌占肠道微生物群的0.1%-5%，是用于研究MGB的一种特征明确的模式生物。虽然它爆发对哺乳动物宿主功效至关主要的维生素K和B12，但它也可能诱发患者的精神症状。别的，具有诱导焦虑样行为的小鼠肠道大肠杆菌水平升高。研究者现在对MGB的大部清楚确都是使用经由抗菌处置惩罚的人造动物模子确定的，包括无菌小鼠和无特定病原体（SPF）小鼠。这些动物模子有其自身优势：抗生素处置惩罚的小鼠模子易于研究，但无法评估单个细菌菌株的影响。虽然使用接种了选定微生物无菌小鼠构建的悉生小鼠模子是研究特定菌株的金标准，但其心理影响在自然情形中可能不具有代表性。别的，使用悉生生物模子的研究既耗时又腾贵。
本文中，研究者提出了一种新的动物模子，该模子团结了悉生小鼠模子在细菌菌株精度方面的优点，以及仅使用通俗小鼠即可建设的便当性。通过使用裂解噬菌体，可以在动物模子中靶向敲除特定的肠道细菌。为了证实这一假设的可行性，研究者选用大肠杆菌特异性噬菌体T7去除康健小鼠肠道中的大肠杆菌，并通太过子和表型剖析来检测其影响(图1)。令人惊讶的是，这些靶向敲除大肠杆菌（TBD）小鼠体现出类似于先前揭晓的抗焦虑和抗抑郁治疗效果的行为转变。与比照组相比，这些原本康健的动物获得了“勇敢”的行为特征，但不过度活跃。因此，本研究批注TBD小鼠模子提供了一种与古板悉生模子互补的要领来验证实验数据，并且可以通过选择差别噬菌体来研究种种肠道细菌。
图1. 靶向细菌敲除（TBD）模子与悉生小鼠模子的较量。TBD模子使用裂解噬菌体来抑制靶向细菌的水平，为悉生小鼠模子提供了一种增补要领。
研究要领
本研究使用康健的6周龄雌性C57BL/6J小鼠，用大肠杆菌噬菌体T7与大肠杆菌（菌株K12）举行处置惩罚。在噬菌体处置惩罚后第0、1、2、4、6、8、10、12和14天网络粪便样品，对小鼠肠道细菌的绝对品貌和多样性举行剖析。本研究行为测试包括：旷场实验、互惠社交互动测试、三箱社交测试、高架十字迷宫试验、新物体识别测试、新颖性抑制饲养试验和悬尾实验。行为实验后，每组随机取3只小鼠，对肠道等器官举行组织学剖析。
研究效果
1. T7噬菌体给药对小鼠身体状态无显着影响
为了验证研究者的模子，使用靶向大大都大肠杆菌菌株的T7噬菌体。本实验通过小鼠胃内给药处置惩罚方法，划分设置了106 PFU/mL T7（T7L）、1011 PFU/mL T7（T7H）、1011 PFU/mL 失活T7（高压灭菌处置惩罚）（dT7H）和水处置惩罚共4个平行组，丈量种种生命体征，网络粪便样本，并按期举行一系列行为测试（图2A）。正如预期的那样，T7噬菌体处置惩罚对小鼠的身体状态没有显着影响（图2B)
图2. T7噬菌体抑制大肠杆菌水平但不影响身体状态和肠道细菌的总量。（A）本研究中使用的时间框架和行为测试的示意图（每组n = 12）。OFT，旷场实验；RSIT，互惠社交互动测试；TCST，三箱社交测试；EPM，高架十字迷宫试验；NOR，新物体识别测试；NSF，新颖性抑制饲养试验；TST，悬尾实验。（B）身体状态：在差别时间丈量的体重（左），逐日饮水量（中）和逐日食物摄入量（右）（每组n = 12）。
2. T7噬菌体选择性敲除大肠杆菌但不影响肠道细菌总量
研究者使用qPCR来量化大肠杆菌和肠道细菌的总量，以跟踪噬菌体给药后的动态转变。在14天的历程中，所有组中的肠道细菌总数没有体现出显着的转变。然而，与比照组相比，T7H组的大肠杆菌迅速降低至～10%，并在第14天逐渐恢复至～25%，可能是由于其对噬菌体的获得性抗性。别的，T7L组中大肠杆菌的下降在第6天后最先，并在第8天时抵达与T7H组相同水平（图2C）。
图2. T7噬菌体抑制大肠杆菌水平但不影响身体状态和肠道细菌的总量。（C）通过qPCR随时间定量的大肠杆菌水平（左）和总细菌水平（右）随时间转变（每组n = 12）。
3. 大肠杆菌的敲除导致肠道微生物群中物种代表性镌汰
为了研究大肠杆菌镌汰的级联效应，研究者通过对16S rRNA基因扩增子（V3-V4区）举行测序来量化微生物分类单位的绝对品貌，以评估肠道微生物群的动态转变。实验在4个时间点（即0天和T7噬菌体处置惩罚后4、8和14天）研究了粪便微生物群组成。效果发明Chao1指数保存显著差别，但T7噬菌体对香农指数和辛普森多样性指数没有显著影响。相关于比照小鼠，大肠杆菌敲除小鼠的肠道中细菌富厚度降低（图3）。时间和T7噬菌体对微生物组成的β多样性均有显著影响（图3D）。随着T7噬菌体处置惩罚，敲除大肠杆菌小鼠肠道微生物群β多样性逐渐降低，其β多样性在第8天升高，但在第14天下降。在噬菌体灌胃后第4天和第14天，大肠杆菌敲除小鼠中25和31个肠道细菌属的绝对品貌与比照小鼠保存差别。别的，24个肠道细菌属的品貌体现出显着的纵向转变，而两组之间微生物群的纵向改变模式差别（图3E）。
图3.大肠杆菌敲除引起肠道微生物群的动态转变。（A-C）肠道微生物群α多样性指数（香农、辛普森和Chao1）。（D）基于Bray-Curtis距离的主坐标剖析（PCoA）。（E）受T7噬菌体调控并随时间显著转变的24个细菌属的品貌转变热图：左为比照组，右为T7组。
4. 大肠杆菌敲除的小鼠体现出行为异常
为了探讨肠道大肠杆菌对宿主的影响，研究者举行了7项行为测试，涵盖精神状态和社交能力，其中五项测试显示T7H组与比照组相比有显著差别。在旷场实验（OFT）中，虽然每组的总距离没有差别（批注各组之间的基础运动活性相似），但T7H小组在明亮的旷场破费了更多时间，并体现出类似于服用抗焦虑药的行为模式（图4A）。
图4. 大肠杆菌敲除小鼠体现出抗焦虑药治疗的行为模式。（A）旷场实验。
在高架十字迷宫（EPM）实验中，T7H组小鼠更频仍地进入开放臂，并一连更长时间，这与先前报道的抗焦虑小鼠模式相似（图4B）。在新颖抑制摄食（NSF）实验中，由于NSF对急性抗焦虑药和慢性抗抑郁药治疗敏感，但对急性抗抑郁药不敏感，因此两个T7处置惩罚的动物组都体现出类似于之前形貌的服用抗焦虑药的行为（图4C）。在悬尾实验（TST）中，T7H和T7L组小鼠的不动时间显着短于比照组（图4D）。
图4. 大肠杆菌敲除小鼠体现出抗焦虑药治疗的行为模式。（B）高架十字迷宫试验。（C）新颖性抑制饲养测试。（D）悬尾实验。
TST通常用于评估抗抑郁活性，这一实验证实噬菌体T7可有用抗抑郁，但不可证实其抗焦虑。相比之下，这些群体的一样平常社交能力和对社会新颖的兴趣之间没有差别。这些指标通过三箱社交测试（TCST）举行评估，自闭症相关的行为缺陷通过互惠社交互动测试（RSIT）评估，小鼠的学习和影象力通过新物体识别（NOR）测试举行评估，这批注小鼠的一样平常社交能力和影象力不受噬菌体影响（图4E）。值得注重的是， T7L组的大肠杆菌量在第8天下降到T7H组的水平，正是在这个时间点，T7L组最先体现出与T7H相似的行为异常。因此，两个实验组的效果同时批注，小鼠的行为障碍与大肠杆菌种群直接相关，而并非与整个肠道微生物群的级联效应相关。
图4. 大肠杆菌敲除小鼠体现出抗焦虑药治疗的行为模式。（E）三箱社交测试
5. 噬菌体处置惩罚小鼠的主要器官未发明病理异常
在剖解学上，各组小鼠小肠和大肠上皮体现出反应性增生，保存了正常的腺体结构和核极性（图4F），细胞显示出核质比轻度增添，细胞核略微增大，核深染和有丝破碎率增添，而不保存显着的多形性和非典范有丝破碎。别的，其他主要器官没有视察到异常，即脑、心、肺、肝、脾和肾的病理形态在所有组间没有差别，批注宿主的心理康健与行为改变可能无关。
图4. 大肠杆菌敲除小鼠体现出抗焦虑药治疗的行为模式。（F）各组小肠和大肠上皮细胞病理形态均体现为反应性增生，各组间坚持正常腺体结构和核极性。
6. 行为恢复与大肠杆菌种群的恢复相关
大肠杆菌在第14天逐渐恢复到T7处置惩罚前水平的25%，进一步确定噬菌体干预后细菌是否可以完全恢复正常很是主要（图2C）。研究者使用qPCR实验对T7H组和比照组举行粪便大肠杆菌水平追踪实验。第16天的大肠杆菌水平约为比照组的30%，与上一次实验中第14天视察到的水平相似（图5A）。随着细菌水平继续恢复，在约莫第24天恢复到噬菌体处置惩罚前的水平。为了确认行为异常是由于大肠杆菌敲除引起的，研究者还通过将大肠杆菌灌胃到T7处置惩罚的小鼠举行了拯救实验（图5B）。
研究者在第0天（基线）、第4天（T7H管饲后）和第8天（大肠杆菌管饲后）使用TST评估小鼠行为。qPCR效果显示，在14天的实验中，由于口服强饲噬菌体和大肠杆菌，大肠杆菌水平泛起波动（图5B）。处置惩罚前、T7H处置惩罚后和大肠杆菌拯救实验后的TST效果反应切合粪便大肠杆菌的水平（图5C）。值得注重的是，第8天的效果批注，小鼠在重新引入大肠杆菌后恢复正常。
图5. 大肠杆菌自我恢复与拯救实验。(A）T7处置惩罚组肠道大肠杆菌水平在14天实验后逐渐恢复（数据从第16天最先），并在第24天恢复到噬菌体处置惩罚前水平。(B）T7处置惩罚组与比照组在14天拯救实验时代的肠道大肠杆菌水平，在第4天施用噬菌体，在第8天给予大肠杆菌灌胃（n = 12）。(C）第0，4和8天的TST效果显示小鼠的行为转变与大肠杆菌的敲除和重新引入之间的相关性。
实验结论
无菌和悉生小鼠模子已被普遍用于肠道微生物群研究，以证实某些细菌与人类疾病之间的直接联系。虽然这种要领为确定接种微生物在受控情形中的详细孝顺提供了优势，但它没有思量群落中的一样平常微生物群，特殊是由于一种细菌转变而导致的物种代表的转变。以前使用悉生动物对大肠杆菌的研究批注晰肠道防御能力的增强以及对精神的作用。别的，口服大肠杆菌已被证实会增添康健小鼠的焦虑样行为，并且大肠杆菌衍生的脂多糖（LPS）被证实在抗抑郁药样行为而非抗焦虑样行为中施展主要作用。
本研究中的大肠杆菌敲除TBD模子证实晰大肠杆菌在具有完整肠道微生物群的野生型小鼠中的神经学作用。这些小鼠体现出奇异的“勇敢”行为特征，与先前揭晓的由团结抗焦虑药和/或抗抑郁药治疗引起的行为模式有一定水平的相似性。
通过检测大肠杆菌的量和细菌多样性随时间的转变，研究者得出结论，大肠杆菌品貌转变是导致视察到的行为转变的缘故原由，研究者推测除了LPS之外，其他大肠杆菌衍生物也可能是引起这种行为转变的缘故原由。能够随着时间的推移快速评估目的细菌和微生物群情形，比仅单独检测选定细菌的悉生模子具有显着优势。同时，大肠杆菌噬菌体作为单剂量提供抗抑郁或抗焦虑作用以治疗抑郁症或焦虑症的潜在应用应当在未来的研究中进一步研究。这种经济有用又省时的TBD模子将加速肠道细菌与康健之间新相互作用的建设
该研究获得国家科技部重点专项、国家自然科学基金、陕西省重点研发妄想的资助，并获得了西安交通大学第一隶属医院生物样本信息资源中心和脑科学研究中心的鼎力大举支持。
西安交通大学博士生李琰清，西安交通大学第一隶属医院朱峰教授、李燕教授为文章配合第一作者，刘冰教授、马现仓教授、王亚文教授为文章配合通讯作者。